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高脂樣本甘油檢測(cè)試劑盒適用范圍

描述：甘油是甘油三酯的水解產(chǎn)物。與游離脂肪酸一樣，甘油含量是甘油三酯水解反應(yīng)的可靠檢測(cè)指標(biāo)，但檢測(cè)更加方便。本試劑盒采用優(yōu)化步驟，能夠檢測(cè)實(shí)體組織、細(xì)胞中的甘油含量，線性范圍為10-1200µmol/L。

原理：在ATP存在下甘油被甘油激酶化為3-甘油，再被甘油氧化酶氧化產(chǎn)生過(guò)氧化氫；在過(guò)氧化物酶作用下生色底物轉(zhuǎn)化為苯醌亞胺，其光密度值與甘油濃度成正比。

適用范圍：測(cè)定實(shí)體組織、細(xì)胞中的甘油濃度。

所需設(shè)備：酶標(biāo)儀、生化分析儀或721、722型可見(jiàn)光分光光度計(jì)。佳工作波長(zhǎng)550nm，如無(wú)此波長(zhǎng)建議優(yōu)先選用570nm、次選530、490nm。

一 組織細(xì)胞裂解

細(xì)胞(包括分化的脂肪細(xì)胞)裂解：

消化、離心收集細(xì)胞。或直接在培養(yǎng)皿內(nèi)裂解。通常6孔板單孔約2x10⁶個(gè)細(xì)胞，75cm²瓶約1x10⁷細(xì)胞。按比例每1~2 x 10⁶細(xì)胞加0.1ml裂解液，震蕩或渦旋裂解后，靜置10分鐘。

動(dòng)物組織裂解：

切記要預(yù)先將新鮮組織剪切稱重后再進(jìn)行保存。組織凍存后再進(jìn)行解凍、剪切、稱重可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的測(cè)量誤差。離心管精確稱重，加入組織塊后再稱重，二者相減(即減量稱重法)計(jì)算組織重量(約100mg)。強(qiáng)烈建議按比例每1mg組織加10µl裂解液以減少樣品間蛋白和脂質(zhì)含量變異而產(chǎn)生的誤差。（注意；裂解液用量在1ml或更多可保證有效的裂解與脂質(zhì)提取）。用電動(dòng)高速勻漿器或手動(dòng)玻璃勻漿器破碎組織。（不推薦超聲方法，因其不能*和均勻破碎。應(yīng)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整初始的組織細(xì)胞加入量），而后，靜置10分鐘。

裂解液處理：

1.    取適量上清液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，進(jìn)行步驟2的操作。余下的裂解液可用BCA法蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量或－20oC儲(chǔ)存。

2.    70oC 加熱10分鐘滅活脂肪酶，可能出現(xiàn)絮狀沉淀。

3.    室溫5000rpm離心5分鐘，上層清液即可用于酶學(xué)測(cè)定。

甘油測(cè)定

1.    參見(jiàn)下表加樣。待測(cè)樣品體積10µl，多加可能會(huì)抑制反應(yīng)。

2.    37oC或25oC反應(yīng) 10分鐘。反應(yīng)平衡后顏色在60分鐘內(nèi)穩(wěn)定。

3.    先用蒸餾水+工作液的空白管調(diào)零，然后測(cè)定各管OD值。

4.    繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算甘油濃度。

附Excel作圖步驟：各標(biāo)準(zhǔn)管OD值為y軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為x軸。(1)鼠標(biāo)左鍵圈住數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊做圖向?qū)Вx擇-散點(diǎn)圖-，點(diǎn)擊-完成-。(2)鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)圖上的某一點(diǎn)，點(diǎn)擊-添加趨勢(shì)線-，點(diǎn)擊-選項(xiàng)-，點(diǎn)擊-顯示公式-和-R²值-。

說(shuō)明：

1. 維生素C>0.18g/L、血紅蛋白>2g/L、膽紅素>0.25g/L、二硫蘇糖醇、巰基乙醇、高濃度EDTA干擾測(cè)試。

2. 紅細(xì)胞糖酵解時(shí)合成甘油影響測(cè)定。